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2005年10月16日 作者:ctnyzn [返回]
转基因荧光诱导技术理论之二

 本技术涉及使用两种或多种核苷酸序列以构建植物细胞内的生物发光机制。所得植物将发光至少部分给定时段。优选的是让植物在晚上发光或至少数小时发光。

    本技术可施用给任何类型的植物。在景观植物和室内植物中,本技术是尤其理想的。树木,灌木,花草是本技术所用的理想植物。这些植物通常发现在居家庭园的景观中,其中增加的安全性和令人愉快的外观是高度理想的。单子叶植物,诸如草和棕榈,以及双子叶植物,诸如树和大多数花,可用于本技术中。下述的当今植物转化技术为遗传修饰任何类型的植物提供了手段。

    荧光素酶为本领域所知已有一段时间。它们的多核苷酸和氨基酸序列,染色体座位,晶体结构以及活性位点已得以阐述。水母荧光素酶通常以腔肠素作为底物,在其活性位点处具有酪氨酸肽。以腔肠素为其底物的水母荧光素酶家族包括发光蛋白质,奥贝林(obelin)和海肾(renilla)荧光素酶。这些荧光素酶称作coelenterate荧光素酶,都适用于本技术。在氧和钙存在下,它们能够氧化腔肠素。这使得它们尤其适于使用前腔肠素编码序列。

   一旦选择了合适的荧光素酶/荧光素生物发光机制,则利用适当的核苷酸序列转化或“转染”真核生物细胞。本领域技术人员会意识到,有众多方法用于转染植物细胞。最常见转染植物细胞的方法是利用来自根瘤农杆菌(Agro.bacterium tumefaciens)的“TI”质粒。TI质粒含有T.DNA区段,TI质粒将其转移到已转染植物细胞的染色体中。野生型农杆菌的T.DNA可被长达25Kb的多核苷酸替换。在本技术中,可插入荧光素酶基因,荧光素基因,启动子,以及任选的选择序列和任选的附加控制序列,包括靶向序列,来代替T.DNA。然后,农杆菌转染将产生植物细胞,其中这些多核苷酸序列已被整合到其基因组。通过使植物细胞接触于合适量的激素和营养物,完全成熟的植物可自单个细胞中发育出来。

    根瘤农杆菌TI质粒仅转染双子叶植物细胞,限制了其应用,然而,利用相似的TI质粒,已发现发根农杆菌(Agro-bacteriumrhizogenes)可成功转染单子叶植物细胞。本领域技术人员会意识到,为了成功转染植物细胞,不同类型的植物细胞要求不同类型的质粒和细菌。

    其他转化植物细胞的方法也是存在的。例如,生物弹(biolistics)已用于转化植物细胞。在此方法中,金属微颗粒包被有所需的重组DNA。所述重组DNA可能是上述相同的多核苷酸。接着,DNA包被的微颗粒利用火药,氦气或其他本领域技术人员公知的方法加速至一速度,以致它们可渗透植物细胞。生物弹的优点之一在于,它可用于任何植物细胞上。

    微注射是另一转化植物的方法。该方法包括使用显微针渗透和直接注射DNA至植物细胞核。

    另一适于所有类型植物细胞的转化方法是电穿孔。电穿孔包括使用强大的电脉冲使植物细胞休克。其立刻破坏植物细胞膜导致其中形成孔。然后,周围溶液中的重组多核苷酸由这些孔进入植物细胞。

    另一转化植物细胞的方法是将它们接触聚乙烯醇(PEG)。植物细胞叶绿体接触PEG使得它们立刻可渗透。象电穿孔一样,该方法也使周围溶液中的DNA方便地渗透到细胞中。

    本领域技术人员会意识到,还有其他转化植物细胞的方法,包括使用硅化纤维(silicone fibers)。哪种转化方法最适用,将取决于多种本领域技术人员公知的因素。这些因素包括但不限于,在转化植物细胞的类型,在用荧光素酶和荧光素基因的类型,待插入重组DNA分子的大小,可用的设备以及方法的相对耗费。

    细菌人工染色体“BAC”可与长达350 Kb的重组多核苷酸片段一起用于转化植物细胞。此外,已发现发根农杆菌的TI质粒可成功
转染单子叶植物细胞。二元载体,如同pBIN 20载体,为含有TI质粒和毗连序列的质粒,让它们也转染植物细胞。

    在转化和长成成熟植物的植物细胞中,由重组DNA编码的生物发光机制将依据所用的启动子加以表达,从而导致植物生物发光。

    在本技术一个具体的实施方案中,参照附图1,重组TI质粒10用于转染植物细胞。质粒10包括毒力编码区12,插入区52和非编码区50。非编码区50不编码任何肽,并且没有控制序列。复制(replacation)起点区48含有可被DNA聚合酶识别的序列,并且是质粒开始复制的点。

    毒力区12为相对大的含有多核苷酸序列的操纵子,所述多核苷酸序列编码导致根瘤农杆菌侵入植物细胞的蛋白。这些序列包括virA14,virB 16,virG 18,virC 20,virD 22,virE 24,virF 26和virH 28。由这些基因编码的蛋白和酶检测已受伤植物释放的化学物质。其后,它们连接并侵入植物细胞。它们是TI质粒为了成功转染植物细胞所必须的组分。插入区52含有全部待插入植物基因组的编码和控制序列。左边32和右边30分别由25个碱基对多核苷酸序列组成,所述序列负责把插入区52插入到植物基因组中。限制区54各自包括一系列限制性位点。本领域技术人员对限制性位点十分熟悉。它们是很短的序列,为核酸内切酶所识别,并且利于把多核苷酸序列剪接到T.DNA区。本领域技术人员会意识到,对TI质粒农杆菌有许多公知的修饰。至少有几十种版本的TI质粒,而限制区’54上存在的真正限制性位点将根据使用哪种修饰的TI质粒,通常,使用哪种限制性位点以向其中剪接所需的插入区DNA,而得以确定。质粒没有区别。一般而言,理想的是使用插入区重组DNA的5’和3’端上的不同限制性位点。这可防止质粒自身连接而不是同插入区连接。还有可能在5和3端使用相同的限制性酶。

    序列36编码荧光素酶基因。其受到启动子序列34的调节。在该具体的实施方案中,靶向序列46位于荧光素酶基因序列36的5’端。靶向序列46编码添加到荧光素酶N’端的其他肽序列。该靶向序列导致胞内机构把荧光素酶导向至细胞的特定细胞器官或区域。靶向序列可导向蛋白至多种细胞器官,包括但不限于,高尔基体,线粒体,叶绿体,溶酶体,过氧化物酶体,核小体,或其他细胞器官。包括靶向序列46是任选的,因为荧光素酶/荧光素反应会发生在胞液中,但是,将酶及其底物靶向到特定的细胞器官由于许多原因可能是有利的。多种不同的细胞器官具有最适的pH,更高浓度的氧,ATP和/或钙。同样,将所有荧光素酶和荧光素导向至细胞器官会导致相对浓度更高的酶,从而加速反应。其结果缩短了消耗荧光素所需的时间,但是也增加了生物发光植物的亮度。

    启动子区34可以是多种本领域公知的任何启动子序列。在此具体的实施方案中,使用a/b光活性复合物的Cab2启动子区。当夜幕降临时,Cab2启动子下调下游序列。这表明荧光素酶序列将在黄昏前后终止表达。下调外源序列使得植物使用其能量以及其他天然功能用的氨基酸和核糖体。有可能使用其他从不关闭的启动子,即组成型启动子。还有可能使用在晚间上调而在日间下调的启动子。本领域公知有众多涉及生物钟的启动子区,根据它们所接触到的日光量而调节表达。由于这些植物的生物发光只在黑暗中可见,因此优选的是生物发光由它们所接触到的光量进行调节。然而,这不是必须的,可使用任何需要的启动子。

    多种植物启动子是公知的,并且可用于促进生物发光机构在植物内多种位置中的表达。在开花植物中,诱导花自身生物发光可能是理想的。或者,在结果植物中,仅诱导果实生物发光可能是理想的。生物发光所需的位置,所需的持续时间以及植物物种将确定所用的启动子。

    荧光素编码区40相似地受到启动子区38的调节。优选的是,启动子序列34和启动子序列38是部分相同序列,但这不是必要的。在此具体的实施方案中,荧光素酶利用腔肠素,而编码区40编码前腔肠素肽.一旦基因转录并被翻译成多肽,前腔肠素多肽自发地与自身反应,导致由两个酪氨酸和一个苯丙氨酸组成的环三肽形成腔肠素。腔肠素的半衰期相对较短,即大约1个半小时到两个小时,因此,理想的是,对启动子38使用不同于启动子序列34的启动子序列。该启动子区38包括Cab2或其他在晚间关闭的生物钟启动子。照此,该具体实施方案的生物发光仅在黄昏后持续数小时。更理想的是利用黄昏时开启的启动子。还优选使用不依赖于生物钟的启动子。

    在这具体的实施方案中,荧光素基因40编码前腔肠素。本领域技术人员会意识到,为了形成胞内荧光素,其他荧光素要求代谢途径以及一种基因以上的操纵子。本领域技术人员会意识到,本技术可包括其他更多的复合操纵子代替单个多肽。正如本领域还已知和在此所述,使用其他的荧光素需要使用替代的荧光素酶基因36。

    该具体的实施方案也包括编码卡那霉素抗性的选择序列42。本领域技术人员会意识到,这仅是若干可能的选择序列中的一种。其他遍在抗生素抗性选择序列包括那些给链霉素和潮霉素赋予抗性的选择序列。本领域技术人员还会意识到,选择序列本身是不必要的,因为生物发光本身可用作选择标记。如果需要,使用抗生素抗性或其他选择标记也是可能的。

    某些启动子区要求附加基因以帮助调节。在插入区52中有可能包括这些基因。在这具体的实施方案中,使用Cab2启动子区,而其他控制序列是非必需的。本领域技术人员会意识到,使用Cab2表明,该质粒对于转化拟南芥(arabidopsis)以及其他植物是适当的。采用何种启动子将取决于在转化植物的类型以及生物发光所需的定时。

    图2示出了利用图1所示的质粒形成生物发光植物的方法。将质粒10插入到根瘤农杆菌,并且与叶片62一起置于接种溶液64中。叶片62撕成部分72,其中叶子已受伤。一旦叶片62被接种,将其转移至含有生长培养基76的培养皿66中。生长培养基76具有的营养足以使转染的细胞保持存活。沿着受伤的部分72,叶片62现在具有转染细胞74的区域。将熟化溶液68反复添加到培养皿66中。熟化溶液68包括使转染细胞发育成成熟植物的营养物和激素。在这具体的实施方案中,转染细胞遗留在叶片62上,从而产生单个转基因植物70。本领域技术人员会意识到,各个转染细胞可自动被分离和长成成熟植物。本领域技术人员会意识到,该图表是简化的过程,以及含有许多步骤并且需要若干周或数月的时间才能发育成幼株。在转基因树和大型灌木的情形下,在开发出成熟转基因生物发光植物之前,需要几年时间。

    理想的是,这些转基因生物发光植物是不育的。如果植物不能繁殖,那些反对基因修饰生物体的人们可能更能接受它们。本领域技术人员会意识到,用于使遗传修饰的生物体不育的方法已被开发出来了。胚胎学领域技术人员会意识到,有若干启动子序列受到生物体年龄的调节。当植物第一次发芽时,有些启动子开启,而有些启动子关闭。随着植物老化,这些启动子中有些将最终关闭,而有些启动子则开启。含有待插入到植入基因组中的基因的重组对核苷酸包括受早期发育启动子序列活化的操纵子。这将导致如图1中示为操纵子44的操纵子诱导生成杀死秧苗的毒素,从而阻止植物产生后代。

    在这具体的实施方案中,毒素基因序列44编码抑制胞内机构的核糖体抑制蛋白(RIP)。启动子58具有众多本领域技术人员公知的任何启动子序列,这些序列在萌芽时具有活性,但在其后不久就失活。序列58和44是任选的。

    不是所有的荧光素代谢途径都已得以阐述。然而,本领域技术人员会认识到,完成此项工作有多种方法。一个优选的方法是利用基因组文库。例如,特定物种的整个基因组可被切成若干较短的DNA链。染色体与一种或多种限制性酶混合,导致染色体被切成多条DNA链。然后,限制性酶通过变性或其他本领域公知的方法钝化。接着,DNA链插入到质粒,噬菌粒,粘粒或BAC。本领域技术人员会认识到,该方法常用于形成多种物种的基因组文库。单个植物细胞可以培养皿,液体培养基或其他本领域公知的手段进行培养。利用TI质粒或如上所述的其他方法对它们进行转化。通过转化插入编码荧光素酶蛋白的DNA。使用控制序列,诸如上述卡那霉素抗性,是选择性生长仅被转化的植物细胞的常见方法。成功转化的植物细胞能够表达荧光素酶。Cab2启动子,温度敏感启动子,或其他手段可用于调节荧光素酶基因的翻译和转录。利用由上述方法创建的基因组文库,这些其中具有编码的荧光素酶基因的植物细胞可被第二次转化。本领域技术人员显而易见的是,用于初始转化植物细胞的荧光素酶必须来自DNA文库衍生的同一物种。生物发光领域的技术人员懂得,多种物种的荧光素酶一般与其他物种的荧光素不相容。

    位于质粒,噬菌粒,粘粒或BAC内的控制序列用于制备文库,优选区别于初始转化中所用的控制序列。例如,如果初始质粒具有卡那霉素抗性,则优选的是,第二种转化用多核苷酸序列编码针对另一抗生素,诸如庆大霉素的抗性。然后,转化的植物细胞可生长在既含有卡那霉素又含有庆大霉素的培养基中,以致仅对含有两个质粒的植物细胞加以选择。这导致对其中已掺入荧光素酶基因和部分基因组文库的植物进行选择。本领域技术人员会意识到,编码荧光素代谢途径的操纵子有可能存在于至少一种双转化的植物细胞中。植物细胞生长在为荧光素基因和基因组文库基因提供表达的条件下。任何代谢荧光素的植物细胞将生物发光。这些植物细胞可长成会生物发光的成熟植物。

    此外,理想的是分离生物发光的植物细胞,并且鉴定对荧光素代谢负责的多核苷酸序列。一旦分离出荧光素代谢操纵子,可将其掺入到同样的质粒,噬茵粒,粘粒或BAC中作为原始荧光素酶基因。这个新转化多核苷酸可用于转化植物细胞,由此通过单次转化途径提供生物发光植物细胞。所述细胞可长成生物发光的成熟植物。

上述方法可用于阐述许多物种的荧光素酶/荧光素基因。

    为了利于生物发光,对植物细胞进行附加修饰的一个例子是把勒克斯操纵子加入植物中。通常,勒克斯操纵子据信在植物细胞中是无效的。这部分是由于缺乏可用的黄素单核苷酸,所述黄素单核苷酸不与黄素蛋白结合,在胞液内是游离的,并且以其还原态存在。FMNH:为勒克斯生物发光反应所需的底物。为了确保有足够的FMNH:存在于胞液中,可采取两个步骤。第一步,将FMN还原酶基因掺入转化多核苷酸中。其可通过相同或不同于调节荧光素酶和/或荧光素基因所用的启动子加以调节。一般而言,理想的是,还原酶蛋白的表达量足以提供足量的FMNH:来促进生物发光反应。本领域技术人员会意识到,还原酶蛋白的过表达可能会破坏胞内化学。

    另一调节胞内FMNH:的量的方法是在转化多核苷酸内包括编码对FMNH2代谢所必需的蛋白的操纵子。为了在胞液中提供足量的游离FMNH2,可使用适当的启动子序列。该操纵子可以或不可以包括FMN还原酶基因。

    另一在胞液中提供游离FMNH:的方法是在转化多核苷酸中包括控制序列,所述控制序列在植物细胞内上调天然FMNH:代谢途径。这个上调控制序列自身可受到启动子区的调节,所述启动子区控制天然FMNH2代谢操纵子的上调程度。

    尽管本技术参照附图已经加以描述,但是应该理解,在本发明的实质和范围内,除了在此所示或暗示的之外,还可进行其他和进一步的修饰。

图1

图2

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