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2005年10月16日 作者:ctnyzn [返回]
转基因诱导荧光技术理论之一

    荧光素酶和相应的荧光素已在萤火虫,水母和生活在海洋底部的海洋生命。多年以来,这些组合一直被科学家用来研究基因在多种生物体中的调节和表达。由于表达方便检测,荧光素酶用作极好的标记。

    在当今的涉及生物发光的基因表达分析中,将荧光素酶编码序列放置在待研究启动子区的下游。然后,该重组DNA插入到载体中,再用于转化植物,动物或细菌细胞。荧光索酶基因的表达或不表达取决于启动子的活性。接着,细胞裂解在生物发光缓冲液中,加入荧光素。测量发射光谱。如果样品发光,则表明启动子区己诱导表达。本领域技术人员会懂得,这些是常见的表达分析。

    体内产生荧光素的方法直到最近才已知。这就是为何细胞不得不被裂解并向其中加入荧光素的原因。近年研究探明形成荧光素coelenterrazine的代谢途径。coelentenazine为一小组水母中发现的荧光素酶的底物。这使得荧光素在活细胞中产生。由于此,通过使用合适的核酸分子,任何易受转化影响的生物体现在可被诱导发光。

    根据本研究,荧光素酶和前腔肠素(pre.coelenterazine)在植物细胞内表达。优选的是,它们仅在植物叶子内表达。为了完成此项工作,将荧光素酶和前腔肠素的编码序列借助载体插入植物细胞中。一个使基因表达限制至叶子细胞的方法必须包括仅特异于叶子细胞表达的上游启动子区。已被成功转染的体细胞或其他植物细胞长成成熟植物。从单个植物细胞中生产成熟植物的方法在本领域是众所周知的。将控制序列,诸如rubisco小单元启动子区,或Cab2启动子(另一已知的生物钟启动子)序列插入荧光素酶和前腔肠素编码区的上游。这确保两个基因仅在植物叶子中表达。Rubisco和Cab2在夜晚下调。这意味着两个插入基因在黑暗中也将是下调的。这防止插入基因的表达给植物施加太大的压力。由于腔肠素为易损的有机分子,其半衰期为1.5.2小时,植物的生物发光活性将在黄昏后3.4小时内停止。

    在某些情形下,对编码基因需要使用不同的启动子。具体而言,理想的是使用仅在黑暗中诱导表达的启动子。这将导致生物发光夜晚开始和拂晓结束。本领域技术人员会意识到,存在大量的启动子引起下游表达条件。哪种启动子最理想将依赖于植物品种以及独特于考虑之中的情形的额外因素,并且不需在此加以阐述。

    为了诱导生物发光,除了荧光素酶外,腔肠素还需要氧和钙离子。因此,理想的是使荧光素酶和腔肠素肽靶向特异细胞器官。本领域技术人员会意识到,存在多种多样的已知靶序列可被加入到多肽N端。通过把编码靶序列的多核苷酸序列插入编码序列的5’端而完成此项工作。当这被表达时,靶序列会包括在翻译的多肽中。然后,靶序列将导向多肽至特异细胞器官。为了保证存在任何需要的辅助因子,这可能是需要的。此外,所有多肽在最适pH下起作用。某些细胞器官的内在pH可能对荧光素酶和荧光素是更优选的。多种不同的细胞器官还可能提供改进多肽稳定性的环境。本领域技术人员会认识到,这些仅是许多可使荧光素酶和荧光素靶向到特异细胞器官的因子中的一些. 

   本领域技术人员还会意识到,可能需要将一种或多种其他序列添加到载体中,用于转染。为了活化或钝化,一些用于调节插入的生物发光基因的启动子有可能需要其他蛋白。通常需要转染载体包括选择序列。选择序列编码的基因赋予诸如卡那霉素和链霉素的多种抗生素抗性。这种选择序列一般用于分离已被成功转染的细胞。生物发光也可用作指示剂。因此,使用选择序列是不必要的。已被成功转染的细胞可诱导生物发光,从而从没有被转染的细胞中挑选出来。可能需要包括其他序列,诸如编码转运蛋白或其他目的蛋白的序列。

图1为本技术的重组DNA载体的简图。  

 

图2为形成本技术的转基因植物方法的简图。

 

 

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